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如何做好肥达、外斐试验

2016-12-21来源:检验地带网 阅读: 【字号:
导读: 传统的肥达、外斐试验采用试管法,存在试剂用量大、结果不易观察等缺点,现介绍一种较实用的平板法,试剂用量仅为试管法1/2、结果易判定等优点。

作者:赵晴  昆明市东川区人民医院检验科

肥达反应(Widal test):

用已知伤寒、副伤寒沙门菌的O、H抗原,检测受检血清中有无相应抗体的半定量凝集试验,称肥达反应(Widal test)。本试验与细菌分离培养同时进行或在前者失败的情况下,能辅助诊断伤寒、甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起的肠热症。

外斐反应(Wiel-Felix):

斑疹伤寒等立克次体与变形杆菌某些X株的菌体抗原(OXk、OX19 、OX2抗原)具有共同的耐热性多糖类属抗原,常用后者代替相应的立克次体抗原进行非特异性凝集反应,这种交叉凝集试验称为外斐反应,用于立克次体病的辅助诊断。

传统的肥达、外斐试验采用试管法,存在试剂用量大、结果不易观察等缺点,现介绍一种较实用的平板法,试剂用量仅为试管法1/2、结果易判定等优点。


试验的第一步(准备):

准备一块U型反应板,长18厘米,宽9 厘米,每孔容积1 毫升,并在上面做出清晰标识。

试验第二步(加样):

为方便说明加样步骤,先看反应板示意图:

第五排     ○   ○    ○    ○    ○     ○    ○     ○

第四排     ○   ○    ○    ○    ○     ○    ○     ○

第三排     ○   ○    ○    ○    ○     ○    ○     ○

第二排     ○   ○    ○    ○    ○     ○    ○     ○

第一排     ○   ○    ○    ○    ○     ○    ○     ○

(从底部算起)

 O    H    甲    乙    丙    OXk   OX19    OX2  

操作步骤

 

第一排

(空白对照)

第二排

第三排

第四排

第五排

生理盐水

250ul

-----------

----------

----------

----------

稀释血清

 

----------

(取一塑料试管:3.8ml生理盐水+0.2ml血清)

每孔加250 ul,共计8孔,用去2ml.

补充2 ml生理盐水,每孔加250ul。

补充2 ml生理盐水,每孔加250ul。

补充2 ml生理盐水,每孔加250ul。

血清稀释倍数

----------

1:20

1:40

1:80

1:160

(O、H、甲、乙、丙、OXk 、OX19 、OX2)相应菌液

250ul

250ul

250ul

250ul

250ul

最终稀释倍数

----------

1:40

1:80

1:160

1:320

试验第三步:混匀

用平板混合器以不会导致微量反应板内容物溅出的强度(100转/分)混合3分钟。

试验第四步:恒温

放37℃度水浴箱恒温24小时,放水浴箱时请用纸板或其它物品做必要遮挡,此步不可省略,否则,请看下图:

这是遮盖纸板收集到的水滴。若这些水滴至反应板内,看结果时就真是葫芦僧乱判葫芦案了。做任何试验,细节真的很重要。

结果判定:

结果判定

反应图像

判定

菌液呈点状聚集,外周边缘平滑。

( - )

产生凝集现象,凝集颗粒或絮状在底部呈膜状延展。

( + )

以能清晰见到凝集反应( + )的最高稀释度为凝集效价。

 

肥达反应临床意义:

1、  一般O>1:80,H>1:160,甲、乙、丙>1:80才有临床意义,或在疾病早期及中后期分别采集两次血清,若第二份血清比第一份的效价高4倍以上增高具有诊断价值。

2、  O及甲、乙其中之一项或丙凝集效价增高时,可以诊断副伤寒甲、乙、丙的某一种。

3、  O抗原产生的抗体为lgM, 出现较早,存在于血清的时间较短,与相应的抗血清反应时呈颗粒状凝集;H抗体为lgG, 出现较迟,持续存在的时间较长,与相应的抗血清呈絮状反应。

4、  O高H不高:

a .疾病早期;

b.沙门菌属中其它菌种感染引起的交叉反应;

c.H→O变异的沙门菌引起的感染。

建议一周后复查,如一周后H也有升高,可证实为肠热症。

5、  H高O不高:

a .可能为疾病的晚期;

b.以往患过伤寒、副伤寒或接受过预防接种;

c.回忆反应等。

 

外斐反应临床意义:

1、  血清抗体效价达1:160以上有意义。病程中双份或多份血清试验,若效价有4倍以上增高具有诊断意义。

立克次体病

变形杆菌抗原

OX19

OX2

OXk

流行性斑疹伤寒

4+

+

地方性斑疹伤寒

4+

+

斑点热

4+或+

+或4+

恙虫病

4+

腺热

2+

2、  往往有些病例在整个疾病过程中效价不见上升,如复发型斑疹伤寒及约15%的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。

3、  有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者,其它血清学试验阳性,但其外斐反应可阴性。

4、  恙虫病立克次体和变形杆OXk株有共同的抗原成分,恙虫病患者血清与OXk抗原发生凝集而不与OX19、OX发生凝集。

5、  假阳性反应还发生在变形杆菌尿路感染、伤寒、钩端螺旋体病,回归热、疟疾及各种病因引起的严重肝病的病人血清检查,孕妇也往往呈假阳性反应。因此,对外斐反应结果应结合临床慎重分析和判断。

 

实例分析:

此板肥达、外斐试验结果为阴性。如果足够细心的话,可以看到OXk第二排(血清最终稀释倍数1:40)出现了异常,是因为变形杆菌抗原很不稳定,特别是经保存以后往往会使血清效价增高,尤以OXk抗原为甚。因而一般不宜作长久保存,并应与阳性病人血清校正其凝集性。

此板O抗原第二排(血清最终稀释倍数1:40)出现了凝集,

此板O抗原与相应的抗血清(血清最终稀释倍数1:320)呈现了颗粒状凝集;H抗原与相应的抗血清(血清最终稀释倍数1:320)呈现了絮状凝集。

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